Những người có ảnh hưởng đến việc công bố các công trình của Newton là Robert Hooke và Edmond Halley. Sau một cuộc tranh luận về chủ đề quỹ đạo của một hạt khi bay từ vũ trụ vào Trái Đất với Hooke, Newton đã bị cuốn hút vào việc sử dụng lý thuyết vạn vật hấp dẫn và cơ học của ông trong tính toán quỹ đạo Johannes Kepler. Những kết quả này hấp dẫn Halley và ông đã thuyết phục được Newton xuất bản chúng. Từ tháng 8 năm 1684 đến mùa xuân năm 1688, Newton hoàn thành tác phẩm, mà sau này trở thành một trong những công trình nền tảng quan trọng nhất cho vật lý của mọi thời đại, cuốn Philosophiae Naturalis Principia Mathematica (Các Nguyên lý Toán học của Triết lý về Tự nhiên).

Trong quyển I của tác phẩm này, Newton giới thiệu các định nghĩa và ba định luật của chuyển động thường được biết với tên gọi sau này là Định luật Newton. Quyển II trình bày các phương pháp luận khoa học mới của Newton thay thế cho triết lý Descartes. Quyển cuối cùng là các ứng dụng của lý thuyết động lực học của ông, trong đó có sự giải thích về thủy triều và lý thuyết về sự chuyển động của Mặt Trăng. Để kiểm chứng lý thuyết về vạn vật hấp dẫn của ông, Newton đã hỏi nhà thiên văn John Flamsteed kiểm tra xem Sao Thổ có chuyển động chậm lại mỗi lần đi gần Sao Mộc không. Flamsteed đã rất sửng sốt nhận ra hiệu ứng này có thật và đo đạc phù hợp với các tính toán của Newton. Các phương trình của Newton được củng cố thêm bằng kết quả quan sát về hình dạng bẹt của Trái Đất tại hai cực, thay vì lồi ra tại hai cực như đã tiên đoán bởi trường phái Descartes. Phương trình của Newton cũng miêu tả được gần đúng chuyển động Mặt Trăng, và tiên đoán chính xác thời điểm quay lại của sao chổi Halley. Trong các tính toán về hình dạng của một vật ít gây lực cản nhất khi nằm trong dòng chảy của chất lỏng hay chất khí, Newton cũng đã viết ra và giải được bài toán giải tích biến phân đầu tiên của thế giới.

Newton sáng tạo ra một phương pháp khoa học rất tổng quát. Ông trình bày phương pháp luận của ông thành bốn quy tắc của lý luận khoa học. Các quy tắc này được phát biểu trong quyển Philosophiae Naturalis Principia Mathematica như sau:

Các hiện tượng tự nhiên phải được giải thích bằng một hệ tối giản các quy luật đúng, vừa đủ và chặt chẽ.
Các hiện tượng tự nhiên giống nhau phải có cùng nguyên nhân như nhau.
Các tính chất của vật chất là như nhau trong toàn vũ trụ.
Một nhận định rút ra từ quan sát tự nhiên chỉ được coi là đúng cho đến khi có một thực nghiệm khác mâu thuẫn với nó.
Bốn quy tắc súc tích và tổng quát cho nghiên cứu khoa học này đã là một cuộc cách mạng về tư duy thực sự vào thời điểm bấy giờ. Thực hiện các quy tắc này, Newton đã hình thành được các định luật tổng quát của tự nhiên và giải thích được gần như tất cả các bài toán khoa học vào thời của ông. Newton còn đi xa hơn việc chỉ đưa ra các quy tắc cho lý luận, ông đã miêu tả cách áp dụng chúng trong việc giải quyết một bài toán cụ thể. Phương pháp giải tích mà ông sáng tạo vượt trội các phương pháp mang tính triết lý hơn là tính chính xác khoa học của Aristoteles và Thomas Aquinas. Newton đã hoàn thiện phương pháp thực nghiệm của Galileo Galilei, tạo ra phương pháp tổng hợp vẫn còn được sử dụng cho đến ngày nay trong khoa học. Những câu chữ sau đây trong quyển Opticks (Quang học) của ông có thể dễ dàng bị nhầm lẫn với trình bày hiện đại của phương pháp nghiên cứu thời nay, nếu Newton dùng từ "khoa học" thay cho "triết lý về tự nhiên":

Cũng như trong toán học, trong triết lý về tự nhiên, việc nghiên cứu các vấn đề hóc búa cần thực hiện bằng phương pháp phân tích và tổng hợp. Nó bao gồm làm thí nghiệm, quan sát, đưa ra những kết luận tổng quát, từ đó suy diễn. Phương pháp này sẽ giúp ta đi từ các hợp chất phức tạp đến nguyên tố, đi từ chuyển động đến các lực tạo ra nó; và tổng quát là từ các hiện tượng đến nguyên nhân, từ nguyên nhân riêng lẻ đến nguyên nhân tổng quát, cho đến khi lý luận dừng lại ở mức tổng quát nhất. Tổng hợp lại các nguyên nhân chúng ta đã khám phá ra thành các nguyên lý, chúng ta có thể sử dụng chúng để giải thích các hiện tượng hệ quả.
Newton đã xây dựng lý thuyết cơ học và quang học cổ điển và sáng tạo ra giải tích nhiều năm trước Gottfried Leibniz. Tuy nhiên ông đã không công bố công trình về giải tích trước Leibniz. Điều này đã gây nên một cuộc tranh cãi giữa Anh và lục địa châu Âu suốt nhiều thập kỷ về việc ai đã sáng tạo ra giải tích trước. Newton đã phát hiện ra định lý nhị thức đúng cho các tích của phân số, nhưng ông đã để cho John Wallis công bố. Newton đã tìm ra một công thức cho vận tốc âm thanh, nhưng không phù hợp với kết quả thí nghiệm của ông. Lý do cho sự sai lệch này nằm ở sự giãn nở đoạn nhiệt, một khái niệm chưa được biết đến thời bấy giờ. Kết quả của Newton thấp hơn γ½ lần thực tế, với γ là tỷ lệ các nhiệt dung của không khí.

Theo quyển Opticks, mà Newton đã chần chừ trong việc xuất bản mãi cho đến khi Hooke mất, Newton đã quan sát thấy ánh sáng trắng bị chia thành phổ nhiều màu sắc, khi đi qua lăng kính (thuỷ tinh của lăng kính có chiết suất thay đổi tùy màu). Quan điểm hạt về ánh sáng của Newton đã xuất phát từ các thí nghiệm mà ông đã làm với lăng kính ở Cambridge. Ông thấy các ảnh sau lăng kính có hình bầu dục chứ không tròn như lý thuyết ánh sáng thời bấy giờ tiên đoán. Ông cũng đã lần đầu tiên quan sát thấy các vòng giao thoa mà ngày nay gọi là vòng Newton, một bằng chứng của tính chất sóng của ánh sáng mà Newton đã không công nhận. Newton đã cho rằng ánh sáng đi nhanh hơn trong thuỷ tinh, một kết luận trái với lý thuyết sóng ánh sáng của Christiaan Huygens.

Newton cũng xây dựng một hệ thống hoá học trong mục 31 cuối quyển Opticks. Đây cũng là lý thuyết hạt, các "nguyên tố" được coi như các sự sắp xếp khác nhau của những nguyên tử nhỏ và cứng như các quả bi-a. Ông giải thích phản ứng hoá học dựa vào ái lực giữa các thành phần tham gia phản ứng. Cuối đời (sau 1678) ông thực hiện rất nhiều các thí nghiệm hoá học vô cơ mà không ra kết quả gì.

Newton rất nhạy cảm với các phản bác đối với các lý thuyết của ông, thậm chí đến mức không xuất bản các công trình cho đến tận sau khi người hay phản bác ông nhất là Hooke mất. Quyển Philosophiae Naturalis Principia Mathematica phải chờ sự thuyết phục của Halley mới ra đời. Ông tỏ ra ngày càng lập dị vào cuối đời khi thực hiện các phản ứng hoá học và cùng lúc xác định ngày tháng cho các sự kiện trong Kinh Thánh. Sau khi Newton qua đời, người ta tìm thấy một lượng lớn thuỷ ngân trong cơ thể của ông, có thể bị nhiễm trong lúc làm thí nghiệm. Điều này hoàn toàn có thể giải thích sự lập dị của Newton.

Newton đã một mình đóng góp cho khoa học nhiều hơn bất cứ một nhân vật nào trong lịch sử của loài người. Ông đã vượt trên tất cả những bộ óc khoa học lớn của thế giới cổ đại, tạo nên một miêu tả cho vũ trụ không tự mâu thuẫn, đẹp và phù hợp với trực giác hơn mọi lý thuyết có trước. Newton đưa ra cụ thể các nguyên lý của phương pháp khoa học có thể ứng dụng tổng quát vào mọi lĩnh vực của khoa học. Đây là điều tương phản lớn so với các phương pháp riêng biệt cho mỗi lĩnh vực của Aristoteles và Aquinas trước đó.

Tuy các phương pháp của Newton rất lôgic, ông vẫn tin vào sự tồn tại của Chúa. Ông tin là sự đẹp đẽ hoàn hảo theo trật tự của tự nhiên phải là sản phẩm của một Đấng Tạo hoá siêu nhân. Ông cho rằng Chúa tồn tại mọi nơi và mọi lúc. Theo ông, Chúa sẽ thỉnh thoảng nhúng tay vào sự vận hồi của thế gian để giữ gìn trật tự.

Cũng có các nhà triết học trước như Galileo và John Philoponus sử dụng phương pháp thực nghiệm, nhưng Newton là người đầu tiên định nghĩa cụ thể và hệ thống cách sử dụng phương pháp này. Phương pháp của ông cân bằng giữa lý thuyết và thực nghiệm, giữa toán học và cơ học. Ông toán học hoá mọi khoa học về tự nhiên, đơn giản hoá chúng thành các bước chặt chẽ, tổng quát và hợp lý, tạo nên sự bắt đầu của Kỷ nguyên Suy luận. Những nguyên lý mà Newton đưa ra do đó vẫn giữ nguyên giá trị cho đến thời đại ngày nay. Sau khi ông ra đi, những phương pháp của ông đã mang lại những thành tựu khoa học lớn gấp bội những gì mà ông có thể tưởng tượng lúc sinh thời. Các thành quả này là nền tảng cho nền công nghệ mà chúng ta được hưởng ngày nay.

Không ngoa dụ chút nào khi nói rằng Newton là danh nhân quan trọng nhất đóng góp cho sự phát triển của khoa học hiện đại. Như nhà thơ Alexander Pope đã viết:

Nature and Nature's laws lay hid in night
God said, Let Newton be!
and all was light

Tự nhiên im lìm trong bóng tối
Chúa bảo rằng Newton ra đời!
Và ánh sáng bừng lên khắp lối